Comparacin de dos mtodos de recoleccin de ovocitos bovinos para maduracin in vitro

Producción Agropecuaria/ Sanidad Animal, Mayo 2010, p. 41 - 44
Copyright 2010. Universidad Nacional Experimental Sur del Lago. Vol. 3, N°1
http://www.unesur.edu.ve/unidades/investigacion/revistas.html Comparación de dos métodos de recolección de ovocitos bovinos para
maduración in vitro
, Hector Nava-Trujillo y Venuslira Vílchez 2 1Universidad Nacional Experimental Sur del Lago “Jesús María Semprum” Santa Bárbara de Zulia, Edo. Zulia-Venezuela. 2 Unidad de Investigación en Biotecnología Animal – FCV Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela. Recibido Septiembre-2009/Aprobado Diciembre-2009 Fueron utilizados, trescientos ovarios de bovinos mestizos obtenidos de matadero para determinar el efecto de la técnica de recolección (Aspiración y Slicing), sobre la cantidad y la calidad de ovocitos. En la técnica de aspiración todos los folículos visibles (2–8 mm de diámetro) fueron aspirados (aguja de 18G x 1 ½ pulg.) y en la técnica de “slicing” los folículos fueron seccionados con una hoja de bisturí numero 22. Los ovocitos se clasificaron en base al numero de capas de células del cumulus y la apariencia del citoplasma en ovocitos madurables con más de dos capas compactas de células del cúmulos zona pelúcida bien definida y citoplasma homogéneo; y ovocitos no madurables parcialmente desnudos de células del cúmulos. La variable clasificatoria fue, técnica de recolección, % madurables, % no madurables, promedio ovocitos madurables/ovarios, promedio ovocitos no madurables/ovario y promedio ovocitos totales/ovario. El % ovocitos madurables/ovario 73,49±24,54; 65,17±10,52 y no madurables/ovario 26,5±24,54; 34,82±10,52 para aspiración y slicing, respectivamente (P> 0.05). El promedio de ovocitos/ovario resultó en 4,58±1,05 y 7,03±3,34 para aspiración y slicing, respectivamente (P> 0.05), el promedio de ovocitos madurables/ovario 3,24±1,11 y 4,37±1,45 para aspiración y slicing, respectivamente (P> 0.05) y el promedio de ovocitos no madurables/ovario 1,33±1,40 y 2,66±1,96 para aspiración y slicing, respectivamente (P< 0.05). La recuperación de ovocitos utilizando la técnica de slicing fue mayor por ovario que para la aspiración, lo cual va a depender de la calidad y cantidad de ovarios disponibles. Palabras Clave: Bovino, Ovocito, Aspiración, Slicing
ABSTRACT
Comparison of two recovery methods of bovine oocytes for in vitro maturation They were used, three hundred ovaries of bovine obtained mestizos of slaughterhouse to determine the effect of the gathering
technique (Aspiration and Slicing), about the quantity and the oocyte quality. In the aspiration technique all the visible follicles
(2–8 mm of diameter) they were aspired (needle of 18G x 1 ½ pulg.) and in the slicing technique the follicles were cut with
a scalpel leaf I number 22. The oocytes was classified based on the I number of layers of cells of the cumulus and the appearance
of the cytoplasm in oocytes madurables with but of two compact layers of cells of the heaps, area very defined pelucida and
homogeneous cytoplasm; and oocytes not partially naked madurables of cells of the heaps). The classificatory variable was,
gathering technique,% madurables,% non madurables, average oocytes madurables/ovariam, average oocytes non
madurables/ovariam and average oocytes totales/ovariam. The % oocytes madurables/ovariam 73,49±24,54; 65,17±10,52 and
non madurables/ovariam 26,5±24,54; 34,82±10,52, for aspiration and slicing (P > 0.05). The average of oocytes/ovariam 4,58±1,05
and 7,03±3,34, for aspiration and slicing (P > 0.05), the average of oocytes madurables/ovariam 3,24±1,11 and 4,37±1,45, for
aspiration and slicing (P > 0.05) and the oocytes average not madurables/ovariam 1,33±1,40 and 2,66±1,96, for aspiration and
slicing (P < 0.05). The oocytes recovery using the slicing technique was bigger for ovary than for the aspiration, that which will
depend on the quality and quantity of available ovaries.
Keywords: Bovine, Oocyte, Aspiration, Slicing.
INTRODUCCIÓN
sean de buena calidad (citoplasma homogéneo y varias capas a mayor importancia de los métodos de recolección de compactas de células del cumulus) recuperados por ovarios, ovocitos es maximizar él numero total de ovocitos y que estos que puedan ser utilizados para la maduración, fecundación y cultivo in vitro. (Gonzalez y col. 1992; Katska 1984).
*Correspondencia: adiher@cantv.net Profesor Asistente de la UNESUR, Campus Universitario, Coordinación de investigación, Santa
Bárbara de Zulia-Venezuela Telf.: 0275-5552832, ext. 137.
Hernández-Fernández et al., 2010 Las células del cumulus son un complejo metabólico para Para la producción in vitro de embriones, la eficiencia el ovocito, por las uniones gap heterologas (LI y col. 2000; del método de recolección y la clasificación de los ovocitos Shimada y col. 2001) y su papel como modulador del efecto son un prerrequisito. Muchos métodos tales como la de las hormonas y factores de crecimiento (Byskov y col. 1997; aspiración del material folicular, la disección de folículos Shimada y col. 2003), durante la maduración in vitro de aislados individualmente y el Slicing de los ovarios han sido ovocitos bovinos, siendo documentada en varias especies descritos para obtener ovocitos inmaduros de ovarios (Petr y col. 1989; Apa y col. 1994; Shimada y Terada 2002; procedentes de matadero. Sin embargo, técnicas como el Yamashita y col. 2003). La maduración de ovocitos bovinos slicing de los ovarios, lavado de los folículos con solución involucra modificaciones en el citoesqueleto de las células salina fosfatada y busferada (PBS) o la ruptura de folículos del cumulus, en términos de reorganización de microtubulus, aislados puede incrementar el número de ovocitos la cual es dependiente de las hormonas y pueden regular la recuperados comparado con la aspiración del material progresión y completación de la maduración ovocitaria (Allworth y Albertini 1993). Además la presencia de unas El objetivo del presente estudio fue comparar la pocas capas de células del cumulus influyen en el proceso de recuperación en cantidad y calidad de ovocitos bovinos maduración, lo cual puede estar influido por el método de procedentes de ovarios de matadero por las técnicas de recolección de los ovocitos. (Ahmed y col. 2001; Katska 1984) aspiración folicular y a través de Slicing. MATERIALES Y MÉTODOS
Animales, diseño experimental y colección de ovocitos
Un total de 300 ovarios no seleccionados fueron obtenidos de
petri fue dejado en reposo por aproximadamente 15 minutos, vacas mestizas, sacrificadas en un matadero local se procedió a decantar cuidadosamente el sobrenadante del (MATOCA), ubicado en la población de la Concepción, cilindro graduado y se tomo el sedimento colocándolo en una Municipio Jesús Enrique Losada del Estado Zulia. Los ovarios placa de petri para su observación en una lupa estereoscópica fueron transportados en solución fisiológica al 0,9 %, a una temperatura de 30 – 35 ºC, hasta el laboratorio de fecundación La clasificación de los ovocitos colectados fue determinado in vitro de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la de acuerdo al número y compactación de las células del Universidad del Zulia. Alrededor de dos horas después de la cúmulos y al grado de homogeneidad del citoplasma en dos recolección los ovarios fueron lavados tres veces clases; A ovocitos con más de dos capas compactas de células sucesivamente en una solución de PBS. del cumulus, zona pelúcida bien definida y homogeneidad Los ovarios colectados fueron divididos en dos grupos. En del citoplasma, competentes para la maduración in vitro; B el grupo I (técnica de slicing 153 ovarios), los ovarios después ovocitos parcialmente desnudos de células del cumulus. de fijados con una pinza hemostática curva fueron superficialmente seccionados longitudinal y transversalmente Análisis estadístico
todos los folículos visibles con una hoja de bisturí, cada Las variables analizadas fueron: técnica de recolección, ovario fue sumergido por separado en un medio de lavado en número de ovarios, número total de ovocitos recolectados, número de ovocitos buenos, número de ovocitos malos, En grupo II (técnica de aspiración, 147 ovarios), todos los porcentaje de ovocitos buenos, porcentaje de ovocitos malos, folículos visibles de 2 – 8 mm de diámetro fueron aspirados promedio de ovocitos buenos por ovarios, promedio de con una jeringa de 10 mL con una aguja de 18G x 1 ½ ovocitos malos por ovario y promedio de ovocitos totales por pulgada, volúmenes de 5 – 10 mL fueron depositados en un ovario. Los datos fueron analizados por medio de un análisis de varianza y P 0,05 fue considerado significativa (SAS, En ambas técnicas, después de la colección de los ovocitos, el contenido del cilindro graduado, como de las placas de RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La caracterización de la apariencia morfológica y la
El número de ovocitos recolectados fue de 124 ± 35,14 y determinación del estado meiótico de ovocitos inmaduros, 192 ± 94,30 para la técnica de aspiración y slicing, son parámetros importantes para mejorar los procedimientos respectivamente (Tabla 1) obteniéndose un mayor número de in vitro de los gametos; tales como la maduración in vitro y la ovocitos por la técnica de slicing, similar a lo reportado por fecundación in vitro (MIV-FIV). Las características de los González y col (1992), Hamano y Kuwayma (1993), Martino y ovocitos originarios de los folículos antrales han sido col. (1992), Shirazi y col. (2005) y Das y col. (1996), sin que se descritas en diferentes especies, como en el ratón (Ericsson y observase diferencia significativa (P> 0.05). Lorenzo y col. Sorensen, 1974) y ganado (Rajakoski, 1960; Leibfried y Frist 1996, reportaron en conejo una baja tasa de recuperación por la técnica de aspiración, que puede deberse a la dificultad en Estudios en conejo y en ganado indican que a través de la desprender los ovocitos de las células de la granulosa técnica de slicing se recolectan un gran número de ovocitos folicular. En la aspiración folicular se tiende a perder solo comparado con la aspiración folicular (Arlotto y col, 1990). células del cumulus como ocurre en el ganado (Katska, 1984). Producción Agropecuaria/Sanidad Animal Comparación de dos métodos de recolección de ovocitos bovinos para maduración in vitro Tabla 1. Número y características de ovocitos recolectados de vacas mestizas por las técnicas de “Slicing” y Aspiración.
* Numero con letras diferentes entre la misma columna difieren significativamente (O<0,05) COC: Complejo Cumulus Ovocito. PmOvarios: Promedio por Ovarios. PmBuenos: Promedio de ovocitos buenos. PmMalos:Promedio de ovocitos Malos El número de ovocitos buenos y malos fue de 95,2 ± 48,92; (1992), atribuyen esta condición como un factor de la técnica 28,8 ± 21,51 y 122,6 ± 54,71; 70,0 ± 47,86, para la técnica de de recuperación de poblaciones heterogéneas de ovocitos de aspiración y slicing respectivamente (P> 0.05). Estos todos los folículos pequeños en el estroma ovárico y que resultados indican que la técnica de slicing produce un muchos de estos ovocitos no se han desarrollado (Figura 1). número mayor de ovocitos malos por ovario. Martino y col. Figura 1. Microfotografías: ovocitos de bovinos vistas al lente 10X a) Buena calidad. b) Mala calidad.
En conejos no hubo diferencias significativas en la Búfalas, quienes observaron que la técnica de slicing produjo proporción de ovocitos recuperados por ambos métodos; mayor cantidad de ovocitos de buena calidad por ovario, indicando que las capas de células del cumulus alrededor del cuando se compararon con los ovocitos recolectados por la ovocito no fueron dañadas durante la aspiración, esto probablemente se debe al uso de una aguja de diámetro El promedio de ovocitos por ovario fue de 4,58 ± 1,05 y suficiente para no producir daño a las capas de células del 7,03 ± 3,34, para la técnica de aspiración y slicing, cumulus de los ovocitos (Lorenzo y col. 1996) respectivamente (P> 0.05), el promedio de ovocitos buenos El porcentaje de ovocitos buenos y malos por ovario fue de por ovario fue de 3,24 ± 1,11 y 4,37 ± 1,45, para aspiración y 73,49 ± 24,54; 65,17± 10,52 y 26,5 ± 24,54 ; 34,82 ± 10,52, para la slicing, respectivamente (P> 0.05) y el promedio de ovocitos técnica de aspiración y slicing respectivamente (P> 0.05), malos por ovario fue de 1,33 ± 1,40 y 2,66 ± 1,96, para contrario a lo reportado por Choi y col. (1993) en equinos, aspiración y slicing respectivamente, observándose diferencia Carolan y col. (1994) en Bovinos y Das y col. (1996) en CONCLUSIONES
Ambos métodos pueden producir una gran cantidad de aspiración folicular y Slicing; el Slicing permitió recuperar un ovocitos de calidad aceptable para estudios in vitro en mayor numero de ovocitos por ovario. Sin embargo el animales domésticos. Una rápida operación en la recolección porcentaje de ovocitos buenos para maduración in vitro fue al de ovocitos por la técnica de aspiración, es una ventaja menos numéricamente mayor cuando estos se recolectaron comparada con la técnica de Slicing (reduciendo posibles mediante la técnica de aspiración folicular. alteraciones del pH, temperatura y contaminación bacteriana de los medios); además el mejor método de recolección de Recomendaciones
ovocitos depende del número de ovarios para procesar, sin Deben realizarse más ensayos en cuanto a la determinación del estado reproductivo de la fuente de ovocitos, así mismo A pesar de no observarse diferencias significativas en el en determinar el porcentaje de maduración de estos ovocitos. promedio de ovocitos recuperados entre la técnica de Vol. 3, N°1
Hernández-Fernández et al., 2010
AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad del Zulia y a la Unidad de Investigación en Biotecnología Animal
(UNIBIO).

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Ahmed, S., Omaima, A., and Kandil, M. (2001). Factors affecting
Leigfried, M., and Frist, N. (1979). Characterization of bovine
number of surface ovarian follicles and Oocytes yield and quality follicular oocytes and their ability to mature in vitro. J. Anim. Sci. in Egyptian buffaloes. Reprod. Nutr. Dev. 41:71-77. Allworth, A., and Albertini, D. (1993). Meiotic maturation in
Li, R., Norman, R., Armstrong, D. and. Gilchrist, R. (2000).
cultured bovine oocytes is accomplished by remodeling of the Oocyte-secreted factor(s) determine functional differences cumulus cell cytoskeleton, Dev. Biol. 158: 101–112. between bovine mural granulosa cells and cumulus cells, Biol. Alm, H. and Torner, H. (1994). In Vitro maturation of horse
Lorenzo, P., Rebollar, P., Illera, M., Illera, J., Illera, M., and
Alvariño, J. (1996). Characterization of Rabbit follicular oocytes Apa, R., Lanzone, A., Miceli, F., Mastrandrea, M., Caruso, A.,
and their ability to mature in vitro. Arch. Zootec. 45:25-35. Mancuso, S. and Canipari, R. (1994). Growth hormone induces in vitro maturation of follicle-and cumulus-enclosed rat oocytes, Martino, A,. Palomo, M., Mogas, T. and Paramio, M. (1992).
Mol. Cell. Endocrinol. 106: 207–212.
Influence of the collection technique of prepubertal goat oocytes on in vitro maturation and fertilization, Theriogenology 42 5:859– Arlotto, T., Lebfried-Rutledge and Frist, N (1990). Size
distribution and meiotic competence of bovine primary oocyte from two localization in the ovary. Theriogenology 33:188. Petr, J., Zetova, L., Fulka, J. and Jilek, F. (1989). Quantitative
inhibitory influence of porcine cumulus cells upon the Byskov, A., Anderson, C., Hossaini, A. and. Guoliang, X. (1997).
maturation of pig and cattle oocytes in vitro, Reprod. Nutr. Dev. 29 Cumulus cells of oocyte–cumulus complexes secret a meiotic- activating substances when stimulated with FSH, Mol. Reprod. Rajakoski, E. (1960). The ovariam follicular system in sexually
mature heifers with special referente to seasonal cyclical and left-
Carolan, C., Monaghan, P., Gallagher, M. and Gordon, I. (1994).
righ variations. Acta Endocr. (Copenhaagen) Supp. 52:1. Effect of recovery method on yield of bovine oocytes per ovary
and their developmental competence after maturation, Shimada, M. and Terada, T. (2002). FSH and LH induce
fertilization and culture in vitro, Theriogenology 41 5:1061–1068.
progesterone production and progesterone receptor synthesis in cumulus cells: a requirement for meiotic resumption in porcine Choi, Y., Hochi, S., Braun, J., Sato, K. and Oguri, N. (1993). In
oocytes, Mol. Hum. Reprod. 8 7:612–618.
vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries, Theriogenology 40 5:959–966. Shimada, M,. Ito, J., Yamashita, Y., Okazaki, T. and Isobe, N.
(2003). Phosphatidylinositol 3-kinase in cumulus cells is Das, G., Jain, G., Solanki, V. and Tripathi, V. (1996). Efficacy of
responsible for both suppression of spontaneous maturation and various collection methods for oocyte retrieval in buffalo. induction of gonadotropin-stimulated maturation of porcine oocytes, J. Endocrinol. 179 1: 25–34.
Ericsson, G., and Sorensen, R. (1974). In Vitro maturation of
Shimada, M,. Maeda, T. and Terada, T. (2001). Dynamic changes
mouse Oocytes isolated from late, middle, and pre antral graafian of connexin-43, gap junctional protein, in outer layers of cumulus cells are regulated by PKC and PI 3-kinase during meiotic resumption in porcine oocytes, Biol. Reprod. 64 4:1255–1263. Gonzalez, R., Soto-Belloso, E., Delgado, N., Portillo, G.,
DeOndiz, A. y Velarde, J. (1992). Comparación de dos métodos
de recolección de oocitos de ovarios de bovinos mestizos
Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N. and Hosseini, N. (2005). A
sacrificados. Revista Científica- LUZ 2: 11-13.
comparison of two recovery methods of ovine oocyte for in vitro maturation. Small Ruminat Research. 58, 3:283-286. Hamano, S., Kuwayma, M. (1993). In vitro fertilization and
development of bovine Oocytes recovered from the ovaries of Statistical Analysis System. (2000). User's Guide. SAS. Institute
individual donors: A comparison between the cutting and aspiration methods. Theriogenology. 39:703-712. Yamashita, Y,. Shimada, M., Okazaki, T., Maeda, T. and Terada,
Katska, L. (1984). Comparison of two methods for recovery of
T. (2003). Production of progesterone from de novo-synthesized ovarian Oocytes from slaughter cattle. Anim. Reprod. Sci. 7:461- cholesterol in cumulus cells and its physiological role during meiotic resumption of porcine oocytes, Biol. Reprod. 68 4:1193–
1198.
Producción Agropecuaria/Sanidad Animal Comparación de dos métodos de recolección de ovocitos bovinos para maduración in vitro Vol. 3, N°1

Source: http://www2.unesur.edu.ve/investigacion/descargas/Rev_Vol3_No1/SA_Hernandez-F_etal_2010.pdf