Microsoft word - ames-test.docx

Ames-test
Via de Ames-test wordt nagegaan of een stof al dan niet mutaties in DNA kan veroorzaken, m.a.w. of de stof al dan niet mutageen is. Deze test wordt in vele laboratoria frequent uitgevoerd om tal van gekende en ongekende componenten (bijvoorbeeld in het fijn stof in de lucht bij luchtverontreiniging) te onderzoeken op 2 Principe
Een mutatie is een verandering in de nucleotidevolgorde van het DNA. Door wijzigingen in de nucleotidevolgorde verandert de genetische informatie. Vaak is de mutatie onschadelijk en heeft het geen effect op het fenotype van het organisme. Echter kan een mutatie ook nadelig zijn en een schadelijk effect veroorzaken op het fenotype (bijvoorbeeld ontwikkelen van kanker). Een mutatie kan ook een positief gevolg hebben en resulteren in een nieuwe eigenschap (bijvoorbeeld beter aangepast zijn aan de omgeving). Mutaties liggen aan de basis van de evolutie en spelen een grote rol bij de genetische variatie binnen een soort. Mutaties kunnen van nature optreden door foutief inbouwen van nucleotiden tijdens het kopiëren van het DNA tijdens de celdeling door het enzym DNA-polymerase. Mutaties kunnen echter ook geïnduceerd worden door bepaalde chemische, mutagene stoffen, zoals mosterdgas en HNO2, of door fysische factoren, waaronder ultraviolet licht en ioniserende stralingen. Er bestaan verschillende testen om na te gaan of een stof al dan niet mutageen is. Een voorbeeld van een dergelijke test is In de Ames-test wordt gebruik gemaakt van de bacteriestam Salmonella typhi- murium TA98. Deze stam vertoont een speciale eigenschap, namelijk het niet meer zelf kunnen aanmaken van het aminozuur histidine. Dit is te wijten aan een mutatie in één van de genen van de histidine biosynthesepathway. Deze bacteriën kunnen enkel groeien op voedingsbodems waarin histidine aanwezig is. Door deze bacteriën in aanwezigheid te brengen van een mutagene stof, treden er nieuwe mutaties op waardoor er enkele bacteriën kunnen ontstaan die nu terug histidine kunnen aanmaken. De eerste mutatie in één van de histidinegenen is immers opnieuw gemuteerd naar de oorspronkelijke, natuurlijke toestand. Deze bacteriën worden revertanten genoemd en kunnen terug groeien op voedingsbodems zonder histidine. Door na incubatie met de mutagene stof de bacteriën over te brengen op een voedingsbodem zonder histidine, zullen enkel de bacteriën, die door mutatie histidine opnieuw kunnen aanmaken, kolonies vormen. Indien het gaat over een sterk mutagene stof, dan zullen er veel kolonies op de voedingsbodem verschijnen. Indien het een niet-mutagene stof betreft, worden er geen kolonies verwacht. Echter, er zullen toch enkele kolonies ontstaan, te wijten aan het optreden van spontane mutaties. Het aantal kolonies bij de sterk mutagene stof ligt echter veel 3 Benodigdheden
- 100 µl mutagene stof: 4-nitroquinoline N-oxide (4NQO; 7 µg/ml DMSO) of ethidiumbromide (10 µg/ml H2O) (beide stockeren bij 4 °C) - 100 µl niet-mutagene stof: dimethylsulfoxide (DMSO) (stockeren bij 4 °C) - buis met 1,5 ml vloeibare voedingsbodem: Nutrient Broth (6,5 g/0,5 l H2O; - vaste voedingsbodem begroeid met Salmonella typhimurium TA98 stam: één petriplaat met Nutrient Broth gesupplementeerd met 1,5 % bacto-agar, beënt met Salmonella typhimurium TA98 en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 24 uur - vaste voedingsbodem: 2 petriplaten met Minimal Davis agar (13,3 g Minimal Davis agar/0,5 l H2O; autoclaveren; na afkoelen tot ± 50 °C 25 ml steriele 50 % glucose toevoegen (250 g glucose/0,5 l H2O; filtersteriliseren) - 7 ml Top agar: 3 g bacto-agar en 2,5 g NaCl in 0,5 l H2O (autoclaveren) - 400 µl histidine/biotine oplossing: 12 mg biotine oplossen in 100 ml H20 bij °C; laten afkoelen en vervolgens 10,5 mg histidine toevoegen; - 1 ml fosfaatbuffer: 0,1 mol/l natriumfosfaat pH 7,4 (15,4 ml 0,5 mol/l Na2HPO4 en 4,6 ml 0,5 mol/l NaH2PO4 en 80 ml H2O; filtersteriliseren) - steriele wegwerppipetten: 5 stuks van 1 ml en 1 van 10 ml - bunsenbrander - öse (= oogentnaald) of een steriele swab - lege, steriele, plastieken buizen van 15 ml: 2 stuks 4 Werkwijze
Om de Ames-test eens te demonstreren voor de leerlingen, kan als mutagene stof 4-nitroquinoline N-oxide (4NQO) of ethidiumbromide worden gebruikt. Voorzichtig-heid tijdens het werk met deze stoffen is van groot belang. Deze stoffen kunnen immers kanker veroorzaken. Contact met de huid en de mond moet dus absoluut vermeden worden. Het dragen van handschoenen is een must. In deze kit werd enkel 4NQO meegeleverd. Als niet-mutagene stof wordt DMSO gebruikt. De Ames-test wordt hier in tweevoud uitgevoerd, waarbij een deel van de bacteriën geïncubeerd wordt met 4NQO en een ander deel van de bacteriën met DMSO. ‐ Ent m.b.v. een öse of oogentnaald (of eventueel de steriele swab bijgeleverd in deze kit) op een steriele manier bij de bunsenbrander de Salmonella typhimurium TA98 stam, gegroeid op de petriplaat met vaste Nutrient Broth voedingsbodem, over in de plastieken buis met 1,5 ml vloeibare Nutrient Broth. Laat de stam gedurende ± 24 uur groeien bij 37 °C of ± 48 uur bij kamer-temperatuur. Dit zijn de bacteriën waarop de Ames-test wordt uitgevoerd.   ‐ Warm de buis met topagar op in kokend water (au bain marie) totdat de topagar volledig vloeibaar geworden is. Laat de topagar afkoelen tot ongeveer 45-55 °C, m.a.w. totdat deze met de hand goed kan worden vastgehouden. Let op dat de topagar niet te veel afkoelt, waardoor deze terug opstijft.   ‐ Pipetteer m.b.v. de steriele wegwerppipetten (van 1 ml) in een lege plastieken - 100 µl 4NQO (of 100 µl ethidiumbromide) - 500 µl fosfaatbuffer - 200 µl histidine/biotine oplossing - 200 µl bacteriecellen (uit de vloeibare Nutrient Broth cultuur) Histidine wordt in een lage concentratie toegevoegd, opdat de bacterie-cellen in leven zouden blijven. De concentratie is echter te laag om vermenigvuldiging van de bacteriën toe te laten. - Pipetteer in een tweede lege plastieken buis dezelfde bestanddelen, maar i.p.v. - Voeg aan beide buizen 3,5 ml topagar toe m.b.v. de steriele wegwerppipet (van 10 ml). De topagar mag niet te warm zijn, zodat de bacteriën niet worden afgedood. Giet beide buizen uit elk op een petriplaat met minimal Davis agar. Deze voedingsbodem bevat geen histidine. Laat beide petriplaten gedurende 30 min onaangeroerd staan, zodat de topagar kan opstijven. Deze manier van uitplaten wordt de gietplaatmethode genoemd. Noteer op de platen welkeen de bacteriën, behandeld met 4NQO, en welkeen de bacteriën, behandeld met DMSO, bevat. De platen worden na stolling ondersteboven bij 37 °C geïncubeerd gedurende 2 dagen, of eventueel bij kamertemperatuur gedurende 4 à 5 dagen, of langer totdat de kolonies mooi zichtbaar zijn. - Ruim finaal de werktafel op. Voeg bleekwater, ethanol of een ander bacterie- afdodend middel toe aan de vloeibare Nutrient Broth cultuur. De afgedode cultuur mag in de gootsteen worden leeggegoten. Alle wegwerpmaterialen worden in een plastieken zak verzameld, goed hermetisch afgesloten en vervolgens in de vuilniszak weggegooid. De petriplaat begroeid met de Salmonella stam, wordt met kleefband goed dichtgeplakt, vervolgens in een plastieken zak gestopt, die hermetisch wordt afgesloten, alvorens het geheel in de vuilniszak weg te gooien. De petriplaten van de Ames-test zelf worden na aflezing van de resultaten op dezelfde manier behandeld. 5 Resultaten
Verwacht wordt dat er op de plaat met de DMSO-behandelde bacteriën 20 à 50 kolonies zullen verschijnen en op de plaat met de 4NQO-behandelde bacteriën ongeveer 500 (zie Figuur 1). De Ames-test kan op een analoge manier worden uitgevoerd om na te gaan of een onbekende stof mutageen is. Hierbij wordt de 4NQO omgewisseld met de onbekende stof. Figuur 1. Resultaat van de Ames-test.
Links: + DMSO (niet mutageen)
Rechts: + 4NQO (mutageen)

Source: http://www.katho.be/download/Ames-test(1).pdf